Нуклеазы с цинковыми пальцами

Нуклеазы с цинковыми пальцами (или ZFN) - это инструмент, используемый для нацеливания на гены и изменения ДНК. Это один из трех методов изменения генома с помощью инженерных нуклеаз.

Они состоят из двух частей. Цинковые пальцы - это искусственные молекулы, состоящие из белка и цинка. Каждая из них связывается с определенной ДНК. Нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) - это ферменты, полученные путем соединения цинкового пальца с ферментом расщепления ДНК под названием Fokl. Таким образом, ZFN связывается с определенной последовательностью ДНК, а затем расщепляет ее в двух местах. Обычные клеточные ферменты склеивают концы вместе, за вычетом вырезанной части (репарация ДНК).

Каждый ZFN предназначен для использования на одном гене, который называется "целевым геном" или "целевой ДНК". Они могут быть разработаны для работы на определенных участках генов, чтобы создать желаемые изменения. Два типа изменений ДНК - это мутации, такие как делеции и вставки. Генетические исследования изучают мутировавших животных, чтобы выяснить, что делает конкретный ген.

Трехмерное изображение молекулы цинкового пальца. Цинковые пальцы обозначены синим цветом, а ион цинка - зеленым.

Структура цинкового пальца

Цинковый палец" - это название многих белковых структур. Атом цинка связывает белки и делает их более стабильными. ZFN связываются с парами оснований ДНК. Один цинковый палец может самостоятельно связать около 3 пар оснований.

Функция ZFN

Нуклеазы с цинковыми пальцами состоят из 3-6 цинковых пальцев. ZFN имеют два важных домена: ДНК-связывающий домен и домен расщепления ДНК. Домен расщепления ДНК использует фермент Fokl, который разрушает ДНК.

ZFN могут изменять только те последовательности ДНК, для которых они предназначены. ДНК-связывающий домен связывается с определенной последовательностью ДНК. Для изменения одного гена требуется два ZFN, предназначенных для одной и той же последовательности ДНК. ДНК-связывающие домены связываются с обеими нитями двойной спирали ДНК. ДНК-расщепляющие домены разрывают нить ДНК и вырезают пары оснований гена. Клетки самостоятельно чинят разорванные нити ДНК с помощью репарации ДНК. Делеционные мутации возникают из-за отсутствия пар оснований после репарации ДНК.

Длина последовательности целевого гена также может быть задана. С помощью 3 цинковых пальцев можно изменить минимум 9 пар оснований. Это полезно для удаления и вставки очень коротких последовательностей ДНК и определения их влияния на целевой ген. Также большие последовательности могут быть изменены с помощью более чем одного ZFN.

Использование ZFNs

ZFN были использованы для обнаружения функций генов во многих генетических исследованиях. ZFN могут быть использованы для изменения ДНК любого вида. Еще одной особенностью ZFN является то, что их можно использовать in vivo (в живых организмах). В настоящее время они используются на модельных организмах: растениях, насекомых и рыбах.

Список организмов, участвующих в исследованиях по изменению генов ZFN, включает:

Arabidopsis
Крупный рогатый скот
C. elegans
Кукуруза
Drosophila melanogaster
Лягушки
Мыши
Свиньи
Кролики
Крысы
Морские ежи
Шелкопряды
Соевые бобы
Табак
Зебрафиш

Проблемы при использовании ZFNs

Самая большая проблема с ZFNs - случайное изменение генов, помимо целевого гена. ZFN должен быть сделан так, чтобы найти нужные пары оснований на целевом гене. Эти пары оснований подбираются таким образом, чтобы они были только у целевого гена. ДНК-расщепляющие домены работают с любой последовательностью ДНК, поэтому связывание с неправильной последовательностью гена приведет к его изменению. ZFN, которые выбивают пары оснований для более чем одного гена, не считаются точными.

Вопросы и ответы

В: Что такое нуклеазы с цинковыми пальцами или ZFN?

О: Нуклеазы с цинковыми пальцами или ZFN - это инструмент, используемый для нацеливания на гены и изменения ДНК.

В: Каковы три метода изменения генома с помощью инженерных нуклеаз?

О: Нуклеазы с цинковыми пальцами или ZFN, нуклеазы-эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), и кластеризованные регулярные межсловные короткие палиндромные повторы (CRISPR) - это три метода изменения генома с помощью инженерных нуклеаз.

В: Что такое цинковые пальцы?

О: Цинковые пальцы - это искусственные молекулы, состоящие из белка и цинка, которые связываются с определенной ДНК.

В: Что такое нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFNs)?

О: Нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFNs) - это ферменты, которые образуются в результате слияния цинкового пальца с ферментом расщепления ДНК, называемым Fokl.

В: Что происходит, когда ZFN связывается с определенной последовательностью ДНК?

О: Когда ZFN связывается с определенной последовательностью ДНК, он расщепляет ее в двух местах.

В: Что делают обычные клеточные ферменты после того, как ДНК вырезана?

О: Обычные клеточные ферменты склеивают концы вместе, за вычетом вырезанного участка (восстановление ДНК).

В: Какие два типа изменений ДНК могут производить нуклеазы с цинковыми пальцами или ZFN?

О: Нуклеазы с цинковыми пальцами или ZFN могут производить два типа изменений ДНК: мутации, такие как делеции и инсерции.