Ли унаследовал несколько рабов вместе с Арлингтон Хаусом. Он оказался не очень хорошим хозяином рабов. Он старался быть добрым и отказывался применять пытки. Но рабы знали, что по завещанию им была дарована свобода, и отказывались работать. Ли хотел дать им свободу, но нуждался в их помощи для выполнения работ в Арлингтон-Хаусе. Лично Ли ненавидел рабство, называя его "злом" как для
черных, так и для белых. Но он считал, что рабство должно быть ликвидировано постепенно, иначе экономика Юга потерпит wikt:крах. Однако Ли был согласен с другими южанами, считавшими чернокожих неполноценными. Он верил, что
Бог решит эту проблему в свое время. Ли, как и Томас Джефферсон, испытывал смешанные чувства по поводу рабства.
Избрание Авраама Линкольна в 1860 году вызвало отделение нескольких штатов в знак протеста. Это поставило Ли в сложное положение. Новообразованные Конфедеративные Штаты Америки предложили Ли звание бригадного генерала. Ли не ответил на это предложение. Уинфилд Скотт предложил ему командовать армией американских добровольцев. Он не ответил и на это предложение. В период с 12 по 14 апреля 1861 года американские войска подверглись бомбардировке форта Самтер в Чарльстоне, Южная Каролина. В тот же день Вирджиния вышла из состава Союза. Ли не поддерживал отделение, но он не мог воевать с собственным штатом Вирджиния. 22 апреля 1861 года в Арлингтон-Хаусе Ли подал в отставку со своего поста в армии США. Он сказал своим друзьям, что не будет участвовать во вторжении на Юг. Несколько дней спустя он принял командование всеми войсками Вирджинии.
Сначала Ли не командовал солдатами в бою. Вместо этого он помогал президенту Конфедерации Джефферсону Дэвису принимать военные решения. В 1862 году он стал командующим армией Северной Вирджинии. Он возглавлял эту армию до конца войны. Он выиграл множество сражений, несмотря на то, что армия Союза имела больше людей и оружия. В битве при Геттисберге он попытался вторгнуться в Союз, чтобы закончить войну. Но его армия была разбита, и ему пришлось отступить обратно в Вирджинию.
В течение 1864 и 1865 годов Ли сражался с генералом Союза Улиссом С. Грантом в Вирджинии. В конце 1864 и начале 1865 года Ли и Грант сражались под Ричмондом, штат Вирджиния, в серии боев под названием "Осада Петербурга". В апреле 1865 года Грант вынудил Ли отступить от Ричмонда. После ряда сражений Грант окружил Ли возле Аппоматтокс-Куртхауса и заставил Ли сдаться. Перед капитуляцией он сказал: "Я лучше умру тысячей смертей, чем сдамся".