Направленное развитие
Направленная эволюция (DE) является методом, используемым для производства ферментов для промышленных или медицинских целей.
Метод - белковая инженерия, имитирующая естественный отбор.
Основная идея заключается в том, чтобы пропустить ген через повторяющиеся раунды мутации, создать библиотеку вариантов. Отбор выделяет гены с нужной функцией. Они являются шаблоном для следующего раунда.
Это можно сделать in vivo (в живых клетках бактерий или дрожжей) или in vitro (свободные в растворе или микрокапельках).
Тестирование большего количества мутантов увеличивает шансы найти мутанта с нужными свойствами.
Во время эволюции in vivo каждая клетка (обычно бактерии или дрожжи) трансформируется плазмидой, содержащей различный член библиотеки вариантов. Между клетками различается только интересующий их ген, при этом все остальные гены остаются неизменными.
Клетки экспрессируют белок либо в цитоплазме, либо на поверхности, где его функция может быть проверена. Преимущество такого формата заключается в выборе свойств в клеточной среде, что полезно при использовании развитого белка или РНК в живых организмах.
При отсутствии клеток ДЭ использует трансляцию in vitro транскрипции для получения белков или РНК, не содержащих РНК в растворе или внутри искусственных микрокапель. Преимущество этого метода заключается в том, что он допускает большее количество условий (например, температуру, растворители). Она может экспрессировать белки, которые были бы токсичны для клеток. Более того, эксперименты по эволюции in vitro могут генерировать гораздо более крупные библиотеки (до 1015), потому что библиотечную ДНК не нужно вставлять в клетки. Это часто ограничивает то, что может быть сделано.
Пример направленной эволюции в сравнении с естественной эволюцией. Внутренний цикл показывает три стадии цикла направленной эволюции с имитацией естественного процесса в скобках. На внешнем круге показаны этапы типичного эксперимента. Красные символы обозначают функциональные варианты, бледные - варианты с пониженной функцией.
Обеспечение наследственности
При выделении функциональных белков необходимо, чтобы их гены тоже были выделены, поэтому требуется наличие связи генотип-фенотип.
Это может быть ковалент, где ген мРНК связан с белком в конце трансляции пуромицином.
В качестве альтернативы белок и его ген можно хранить вместе или в эмульсионных капельках. Изолированные последовательности генов затем размножаются с помощью ПЦР или трансформированных бактерий-хозяев. В качестве шаблона для следующего раунда мутагенеза можно использовать либо единственную лучшую последовательность, либо пул последовательностей. Повторяющиеся циклы диверсификации-отбора-ампликации делают ферментные вариации адаптированными к процессу отбора.
Экспрессированный белок может быть ковалентно связан со своим геном (как и в мРНК), слева, или помещен в тот же отсек с ним, справа. В любом случае, ген, который кодирует белок, изолирован.
присуждённая премия
Американский инженер ФрэнсисАрнольд получил премию "Технологии тысячелетия" за новаторство в области направленной эволюции.
Вопросы и ответы
В: Что такое направленная эволюция?
О: Направленная эволюция (DE) - это метод, используемый для производства ферментов в промышленных или медицинских целях. Это форма белковой инженерии, которая имитирует естественный отбор.
В: Как работает направленная эволюция?
О: Направленная эволюция работает, когда ген проходит через многократные раунды мутаций, создавая библиотеку вариантов. Затем отбор выделяет гены с желаемой функцией, которые затем используются в качестве шаблонов для следующего раунда.
В: Где можно проводить направленную эволюцию?
О: Направленную эволюцию можно проводить in vivo (в живых клетках бактерий или дрожжей) или in vitro (свободно в растворе или микрокапельках).
В: Каковы преимущества проведения направленной эволюции in vivo?
О: Направленная эволюция in vivo имеет преимущество отбора свойств в клеточной среде, что полезно, когда эволюционировавший белок или РНК будет использоваться в живых организмах.
В: Каковы преимущества направленной эволюции in vitro?
О: Преимущество направленной эволюции in vitro состоит в том, что она позволяет создать больше условий (например, температура, растворители), и в ней можно экспрессировать белки, которые были бы токсичны для клеток. Кроме того, можно генерировать гораздо большие библиотеки, поскольку ДНК не нужно вводить в клетки.
В: Что ограничивает то, что можно сделать во время эксперимента in vitro?
О: Ограничение на размер того, что можно сделать во время эксперимента in vitro, часто определяется тем, сколько ДНК необходимо ввести в клетки.
