В 539 году до н.э. неовавилонская империя пала перед Киром Великим, царем
Персии, в битве при Описе. Стены Вавилона были очень высокими и толстыми. В город можно было попасть только через одни из многочисленных ворот. Рядом со стенами протекал Евфрат, и Кир решил использовать эту реку, чтобы попасть в город. Войска Кира направили реку Евфрат в другое русло. В результате уровень воды в реке понизился, и солдаты смогли войти в город.
Вечером вавилоняне устроили праздник. Персидская армия захватила большую часть города еще до того, как вавилоняне узнали, что персы вошли в город. Этот рассказ был передан Геродотом, а также упоминается в еврейской Библии. Кир захватил город, пройдя через ворота Вавилона, практически не встретив сопротивления со стороны пьяных вавилонян.
Позже Кир издал указ, разрешающий людям, в том числе и евреям, вернуться на свою землю. Об этом упоминается в Ветхом Завете. Он позволил иудейскому храму быть восстановленным в Иерусалиме.
При Кире и последующем персидском царе Дарии Великом Вавилон стал столицей 9-й сатрапии (Вавилония на юге и Атура на севере). Он был центром обучения и научного прогресса. В Ахеменидской Персии вавилонское искусство астрономии и математики было возрождено. Вавилонские ученые составляли карты созвездий. Город был административной столицей Персидской империи. Эта империя была самой могущественной в известном тогда мире. Было сделано много важных археологических открытий, которые улучшают наше понимание той эпохи.
Первые персидские цари пытались сохранить религиозные церемонии Мардука. К правлению Дария III чрезмерные налоги и многочисленные войны привели к разрушению главных святынь и каналов Вавилона и распаду региона. Несмотря на три восстания в 522, 521 и 482 гг. до н.э., земля и город Вавилон оставались под властью персов в течение двух столетий. В 331 году до н.э. власть захватил Александр Македонский. Под властью Парфянской империи Вавилон продолжал уменьшаться и терять свое значение.