газовая хроматография-масс-спектрометрия

История

Первые научные работы по газожидкостной хроматографии были опубликованы в 1950 году. Химики использовали различные детекторы, чтобы увидеть, что соединения вытекают из конца хроматографа. Большинство детекторов уничтожали соединения, потому что сжигали или ионизировали их. Эти детекторы оставили химикам догадки о точной идентификации каждого соединения в образце. В 1950-х годах Роланд Голк и Фред Маклафферти разработали новую комбинированную машину. Они использовали масс-спектрометр в качестве детектора в газовой хроматографии. Эти ранние приборы были большими, хрупкими и первоначально ограничивались лабораторными установками.

Дизайн был сложным. Временной интервал между различными соединениями, вытекающими из хроматографа, было трудно контролировать. Поэтому масс-спектрометр должен был закончить работу над одним соединением, прежде чем из хроматографа вытекло следующее. В ранних моделях измерения из масссспектрометра записывались на графической бумаге. Высококвалифицированные химики изучали закономерности пиков для идентификации каждого соединения. К 1970-м годам в масс-спектрометры были добавлены аналого-цифровые преобразователи. Это позволяло компьютерам хранить и интерпретировать результаты. По мере того, как компьютеры становились все меньше и меньше, ГХ-МС становились все быстрее и распространялись из лабораторий в повседневную жизнь. Сегодня компьютеризированные ГХ-МС приборы широко используются для экологического мониторинга воды, воздуха и почвы. Они также используются в регулировании сельского хозяйства, безопасности пищевых продуктов, а также в открытии и производстве лекарств.

Развитие малых компьютеров помогло упростить работу GC-MS машин. Это также значительно сократило время, необходимое для анализа образца. Electronic Associates, Inc. (EAI) была ведущим американским поставщиком аналоговых компьютеров. В 1964 г. EAI начала разработку масс-спектрометра с компьютерным управлением под руководством Роберта Э. Финнигана. К 1966 г. было продано более 500 газоанализаторов. В 1967 г. была образована Финниганская приборостроительная корпорация (FIC). В начале 1968 года был поставлен первый прототип четырехполюсных ГХ-МС приборов в Университет Стэнфорда и Пердью. В конце концов, FIC была переименована в Finnigan Corporation и утвердилась в качестве мирового лидера в области GC-MS систем.

Базовая операция

ГХ-МС может найти все соединения, смешанные вместе в образце объекта. Оператор растворяет пробу в жидкости. Затем оператор вводит жидкость в поток газа. (Чаще всего используется гелий, водород или азот) Газ проходит через трубку со специальным покрытием. Поскольку каждое соединение в образце прилипает к покрытию по-разному, каждое соединение выходит из трубки в разное время. Поэтому покрытие используется для разделения каждого соединения, которое смешивалось в образце. Так как каждое соединение выходит на конце трубки, оно ионизируется и получает электрический заряд. Большинство соединений распадается, когда они ионизируются. Различные куски пролетают под магнитом, который разделяет куски в зависимости от их веса и заряда. Затем компьютер измеряет все части каждого соединения. Сравнивая измерения с компьютерной библиотекой известных соединений, компьютер составляет список названий всех соединений в образце. Компьютер также может определить, сколько каждого соединения находилось в образце.

Приборостроение

ГХ-МС состоит из двух основных блоков: газового хроматографа и масс-спектрометра. В газовом хроматографе используется капиллярная колонка, размер которой зависит от размеров колонки (длина, диаметр, толщина пленки), а также от фазовых свойств (например, 5% фенилполисилоксана). Разница в химических свойствах различных молекул в смеси будет отделять молекулы по мере прохождения образца по длине колонки. Молекулам требуется разное время (называемое временем удерживания) для выхода (элюирования) из газового хроматографа. Это позволяет масс-спектрометру, находящемуся ниже по течению, захватывать, ионизировать, ускорять, отклонять и обнаруживать ионизированные молекулы по отдельности. Для этого масс-спектрометр разбивает каждую молекулу на ионизированные фрагменты и обнаруживает эти фрагменты по их соотношению массы к заряду.

Эти две машины, используемые вместе, обеспечивают гораздо более точную идентификацию вещества, чем любая другая единица, используемая отдельно. Точную идентификацию конкретной молекулы невозможно провести только с помощью газовой хроматографии или масс-спектрометрии. Для процесса масс-спектрометрии обычно требуется очень чистый образец. В прошлом для газовой хроматографии использовались другие детекторы, например, пламенно-ионизационный детектор. Эти детекторы не могут разделять различные молекулы, на прохождение которых через колонку уходит одинаковое количество времени. (Когда две разные молекулы имеют одинаковое время удерживания, их называют "со-отклоняющимися"). Сочетание молекул запутает компьютерные программы, которые считывают один массовый спектр для обеих молекул.

Иногда две разные молекулы могут также иметь сходную картину ионизированных фрагментов в масс-спектрометре (масс-спектр). Сочетание этих двух процессов снижает вероятность ошибки. Крайне маловероятно, что две разные молекулы будут вести себя одинаково как в газовом хроматографе, так и в масс-спектрометре. Поэтому, если масс-спектр соответствует интересующему аналитику, время удерживания этого спектра может быть проверено по сравнению с характерным временем удерживания ГХ для повышения уверенности в том, что аналит находится в образце.

Типы масс-спектрометрических детекторов

Наиболее распространенным типом МС, связанным с ГХ, является квадрупольный масс-спектрометр. Компания Hewlett-Packard (ныне Agilent) продает его под торговым названием "Массовый селективный детектор" (Mass Selective Detector, MSD). Другим относительно распространенным детектором является масс-спектрометр с ионной ловушкой. Дополнительно можно найти масс-спектрометр с магнитным сектором. Однако эти приборы являются дорогими и громоздкими и, как правило, не встречаются в высокопроизводительных сервисных лабораториях. Другие детекторы используются, такие как время полета (TOF), тандемные квадруполи (MS-MS) (см. ниже), или в случае ионной ловушки MSn. Число n указывает число этапов масс-спектрометрии.

GC-MS схема


Внутри ГХ-МС, с колонкой газового хроматографа в печи справа.

Анализ

Масс-спектрометр обычно используется одним из двух способов: Полное сканирование или селективный ионный мониторинг (SIM). Типичный ГХ-МС может работать как в одиночку, так и в обоих направлениях одновременно.

Полное сканирование MS

При сборе данных в режиме полного сканирования выбирается и помещается в прибор целевой диапазон фрагментов массы. Примером типичного широкого диапазона фрагментов масс для мониторинга может служить м/з 50 - м/з 400. Определение того, какой диапазон следует использовать, в основном задается тем, что ожидается в образце, но при этом необходимо знать о растворителе и других возможных помехах. Если рассеянный склероз ищет фрагменты массы с очень низким значением m/z, он может обнаружить воздушные или другие возможные интерференционные факторы. Использование большого диапазона сканирования снижает чувствительность прибора. Машина будет выполнять меньше сканирований в секунду, потому что каждое сканирование займет больше времени для обнаружения более широкого диапазона массовых фрагментов.

Полное сканирование полезно при определении неизвестных соединений в образце. Оно дает больше информации, чем SIM, когда речь идет о подтверждении или разрешении соединений в образце. Большинство приборов управляется компьютером, который управляет компьютерной программой, называемой "приборным методом". Приборный метод контролирует температуру в ГХ, скорость сканирования MS и диапазон размеров обнаруживаемых фрагментов. Когда химик разрабатывает инструментальный метод, он посылает тестовые растворы через ГХ-МС в режиме полного сканирования. При этом проверяется время удерживания ГХ и отпечаток пальца фрагмента массы перед переходом к инструментальному методу SIM. Специализированные ГХ-МС приборы, такие как детекторы взрывчатых веществ, имеют приборный метод с предварительной загрузкой на заводе-изготовителе.

Выбранный ионный мониторинг

В выбранном мониторинге ионов (SIM), приборный метод фокусируется на определенных фрагментах ионов. Только эти фрагменты массы обнаруживаются масс-спектрометром. Преимущества СИМ-спектрометра заключаются в том, что предел детектирования ниже, так как при каждом сканировании прибор смотрит только на небольшое количество фрагментов (например, на три фрагмента). Каждую секунду может проводиться больше сканирований. Поскольку отслеживается лишь небольшое количество интересующих фрагментов массы, помехи на матрице, как правило, ниже. Для повышения вероятности правильного считывания положительного результата ионные соотношения различных фрагментов массы сопоставимы с известным эталонным стандартом.

Виды ионизации

После того, как молекулы перемещаются по длине колонки, проходят через линию переноса и попадают в масс-спектрометр, они ионизируются различными способами. Как правило, в любой момент времени используется только один ионизационный метод. Как только образец фрагментирован, он затем детектируется, обычно диодом умножения электронов. Диод обрабатывает ионизированный массовый фрагмент как электрический сигнал, который затем детектируется.

Химики выбирают технику ионизации отдельно от выбора "Полное сканирование" или "Мониторинг SIM-карты".

Электронная ионизация

Наиболее распространенным типом ионизации является электронная ионизация (EI). Молекулы входят в МС (источник - квадруполь или сама ионная ловушка в ионной ловушке МС), где они попадают в свободные электроны, излучаемые из нити накала. Это похоже на нить накала, которую можно найти в стандартной лампе накаливания. Электроны попадают в молекулы, в результате чего молекула фрагментируется характерным для нее способом, который может повторяться. Этот метод "жесткой ионизации" приводит к созданию большего количества фрагментов с низким отношением массы к заряду (м/з). У EI мало фрагментов, если таковые вообще имеются, имеющих массу, близкую к массе исходной молекулы. Химики считают жесткую ионизацию стрельбой электронов в молекулы образца. Напротив, "мягкая ионизация" помещает заряд на молекулу образца, ударяя по ней введенным газом. Структура молекулярной фрагментации зависит от энергии электрона, приложенной к системе, обычно 70 эВ (вольт электрона). Использование 70 эВ помогает сравнивать спектры, генерируемые тестируемым образцом, с известными библиотечными спектрами. (Библиотечные спектры могут быть получены из программного обеспечения, поставляемого производителем, или программного обеспечения, разработанного Национальным институтом стандартов (NIST-USA)). Программное обеспечение производит поиск по библиотечным спектрам с использованием подходящего алгоритма, например, Probability Based Matching (Сопоставление на основе вероятностей) или dot-product (Сопоставление на основе точек-продуктов). В настоящее время многие агентства по стандартизации методов контролируют эти алгоритмы и методы для обеспечения их объективности.

Химическая ионизация

При химической ионизации (ХИ) в масс-спектрометр вводится газ реагента, обычно метан или аммиак. Существует два типа ДИ: положительный ДИ или отрицательный ДИ. В любом случае, газ реагента взаимодействует с электронами и аналитом и вызывает "мягкую" ионизацию интересующей молекулы. Мягкая ионизация фрагментирует молекулу в меньшей степени, чем жесткая ионизация ИИ. Химики предпочитают ИИ, а не ИИ. Это происходит потому, что КИ производит, по крайней мере, один массовый фрагмент с массой, почти равной молекулярной массе интересующего аналита.

Положительная химическая ионизация

При положительной химической ионизации (PCI) газ реагента взаимодействует с молекулой мишени, чаще всего с протонным обменом. В результате этого ионы образуются в относительно больших количествах.

Отрицательная химическая ионизация

При отрицательной химической ионизации (NCI) газ реагента уменьшает влияние свободных электронов на аналит-мишень. Это снижение энергии обычно оставляет фрагмент в большом запасе. (Фрагменты не распадаются дальше).

Интерпретация

Основной целью инструментального анализа является измерение количества вещества. Это делается путем сравнения относительных концентраций среди атомных масс в генерируемом массовом спектре. Возможны два вида анализа - сравнительный и оригинальный. Сравнительный анализ по существу сравнивает данный спектр с библиотекой спектров, чтобы увидеть, присутствуют ли его характеристики для некоторого известного образца в библиотеке. Лучше всего это проводить на компьютере, так как существует много искажений зрения, которые могут иметь место из-за вариаций масштаба. Компьютеры также могут коррелировать большее количество данных (например, время удерживания, определенное ГХ), чтобы более точно соотнести определенные данные.

Другой метод анализа измеряет пики по отношению друг к другу. В этом методе самый высокий пик устанавливается на 100%. Остальным пикам присваивается значение, равное отношению высоты пика к самой высокой высоте. Присваиваются все значения выше 3%. Общая масса неизвестного соединения обычно указывается родительским пиком. Значение этого "родительского" пика может быть использовано для подгонки под химическую формулу, содержащую различные элементы, которые считаются входящими в состав. Структура изотопов в спектре уникальна для элементов, которые имеют много изотопов. Таким образом, он также может быть использован для идентификации различных присутствующих элементов. Это говорит об общей химической формуле неизвестной молекулы. Поскольку структура молекулы и ее связи разрываются характерным образом, их можно идентифицировать по разнице в пиковых массах. Идентифицированная структура молекулы должна соответствовать характеристикам, зарегистрированным в ГХ-МС. Как правило, эта идентификация осуществляется автоматически компьютерными программами, поставляемыми вместе с прибором. Эти программы сопоставляют спектры с библиотекой известных соединений, которые имеют один и тот же список элементов, которые могут присутствовать в образце.

Анализ "полного спектра" рассматривает все "пики" в пределах спектра. Но выборочный ионный мониторинг (SIM) отслеживает только отдельные пики, связанные с определенным веществом. Химики предполагают, что в заданное время удерживания для определенного соединения характерен набор ионов. SIM является быстрым и эффективным анализом. SIM лучше всего работает, когда аналитик имеет предыдущую информацию об образце или ищет только несколько специфических веществ. Когда количество собранной информации об ионах в данном пике газовой хроматографии уменьшается, чувствительность анализа возрастает. Таким образом, SIM-анализ позволяет обнаружить и измерить меньшее количество соединения. Но степень уверенности в идентификации этого соединения снижается.

GC-тандемный МС

При добавлении второй фазы фрагментации масс, например, при использовании второго квадруполя в квадрупольном приборе, она называется тандем MS (MS/MS). МС/МС хорошо измеряют низкие уровни целевых соединений в образце с матрицей фоновых соединений, которые не представляют интереса.

Первый квадруполь (Q1) соединен с ячейкой столкновения (q2) и другим квадруполем (Q3). Оба квадруполя могут использоваться в режиме сканирования или в статическом режиме, в зависимости от типа используемого MS/MS анализа. Типы анализа включают в себя сканирование ионов продуктов, сканирование ионов-прекурсоров, мониторинг селективных реакций (SRM) и сканирование нейтральных потерь. Например: Когда Q1 находится в статическом режиме (смотрят только на одну массу, как в SIM), а Q3 в режиме сканирования, получается так называемый спектр ионов продукта (также называемый "дочерним спектром"). Из этого спектра можно выбрать выдающийся ион продукта, который может быть ионом продукта для выбранного иона-предшественника. Эта пара называется "переход" и образует основу для SRM. SRM является весьма специфическим и почти полностью исключает матричный фон.

Заявления

Мониторинг и очистка окружающей среды

Многие химики считают, что ГХ-МС является лучшим инструментом для мониторинга органических загрязнителей окружающей среды. Стоимость оборудования ГХ-МС значительно снизилась. Одновременно возросла надежность ГХ-МС. Оба эти улучшения привели к более широкому использованию в экологических исследованиях. Некоторые соединения, такие как некоторые пестициды и гербициды, не могут быть идентифицированы с помощью ГХ-МС. Они слишком похожи на другие родственные соединения. Но для большинства органических анализов проб окружающей среды, включая многие основные классы пестицидов, ГХ-МС очень чувствительны и эффективны.

Криминалистическая экспертиза

ГХ-МС может анализировать частицы человеческого тела, чтобы помочь связать преступника с преступлением. Закон допускает использование ГХ-МС для анализа пожарного мусора. Фактически, Американское общество по испытанию материалов (ASTM) имеет стандарт для анализа огненного мусора. ГХМС/МС здесь особенно полезен, поскольку образцы часто содержат очень сложные матрицы, а результаты, используемые в суде, должны быть высокоточными.

правоприменение

ГХ-МС используется для выявления нелегальных наркотиков и в конечном итоге может заменить собак, нюхающих наркотики. Он также широко используется в судебной токсикологии. Она помогает найти наркотики и/или яды в биологических образцах, взятых у подозреваемых, жертв или трупов.

Безопасность

После террористических актов 11 сентября 2001 года системы обнаружения взрывчатых веществ стали частью всех американских аэропортов. Эти системы работают на множестве технологий, многие из которых основаны на GC-MS. Существует только три производителя, сертифицированных FAA для предоставления этих систем. Первым из них является Thermo Detection (ранее Thermedics), которая производит EGIS, линейку GC-MS детекторов взрывчатых веществ. Вторая - Barringer Technologies, которая в настоящее время принадлежит компании Smith's Detection Systems. Третья - Ion Track Instruments (часть системы безопасности общей электрической инфраструктуры).

Анализ продуктов питания, напитков и парфюмерии

Продукты питания и напитки содержат много ароматических соединений, некоторые из которых естественным образом присутствуют в сырье, а некоторые образуются в процессе обработки. ГХ-МС широко используется для анализа этих соединений, которые включают эфиры, жирные кислоты, спирты, альдегиды, терпены и т.д. Она также используется для обнаружения и измерения загрязняющих веществ от порчи или фальсификации, которые могут быть вредными. Эти загрязнители часто контролируются государственными органами, например, пестициды.

Астрохимия

Несколько GC-MS покинули Землю. Двое отправились на Марс по программе "Викинг". Венера 11 и 12 и Пионерская Венера проанализировали атмосферу Венеры с помощью ГХ-МС. Зонд Гюйгенса миссии Кассини-Гюйгенс приземлил одну GC-MS на самую большую Луну Сатурна - Титан. Материал кометы 67Р/Чурюмова-Герасименко будет проанализирован миссией Rosetta с хиральной ГХ-МС в 2014 году.

Медицина

ГХ-МС используются в тестах на скрининг новорожденных. Эти тесты могут выявить десятки врожденных метаболических заболеваний (также известных как врожденная ошибка метаболизма). ГХ-МС может определять соединения в моче даже в очень малых количествах. Эти соединения, как правило, отсутствуют, но появляются у людей, страдающих метаболическими нарушениями. Это становится обычным способом диагностики IEM для ранней диагностики и начала лечения. В конечном итоге это приводит к лучшему результату. Теперь можно проверить новорожденного на более чем 100 генетических метаболических нарушений с помощью теста мочи при рождении на основе ГХ-МС.

В сочетании с изотопной маркировкой метаболических соединений, ГХ-МС используется для определения метаболической активности. Большинство применений основано на использовании ^13С в качестве маркировки и измерении соотношений ^13С-12С с помощью масс-спектрометра с изотопным соотношением (IRMS). ИРМС - это масс-спектрометр с детектором, предназначенным для измерения нескольких выбранных ионов и возвращаемых значений в виде соотношений.